Linked ImmunoSorbent assay (ELISA, ELISA). Podstatou zásady mechanizmu a fáz výskumu. Analýza protilátkových tried protilátok, imunitným komplexom.

V súvislosti s rozvojom mobilných technológií, molekulárnej biológie, genetiky, fyziky, chémie a mnoho ďalších high-tech odborov v každodennej praxi zavádzaní nových vysoko presné a high-tech metód. Tieto trendy ovplyvňujú a interdisciplinárny oblasť medicínskych vedomostí, a príbuzných odborov biologických, biochemických problémov. široko rozšírený a zavedenie rozšíreného spôsobu klinickej laboratórnej diagnostiky, volal enzymoimuno za posledných desať rokov.

Všeobecne platí, že technológia imunologických a enzymatických reakcií rádiologické široko používané v bunkovej písaní, bunkových kultúr rôznych tkanivách od začiatku 80. rokov XX storočia. Avšak, tieto metódy sú veľmi časovo náročné, nejednotné, nie sú štandardizované, čo vylučuje ich použitie v terapeutickej a diagnostické účely v húfoch. Tieto metódy používajú úzky, high-tech a vysoko špecializované laboratóriá.

Avšak, s rozvojom technológií, mikrotechnológií, výrobu rôznych biopolymemích látok umožnili vyrobiť hotové sady ELISA diagnostiku, ktoré budú môcť využívať laboratória zdravotníckych zariadení Bežným. ELISA je široko používaný pre diagnostiku rôznych infekcií (chlamýdie, syfilis, cytomegalovírusu, toxoplazmózy, herpes atď), akútne i chronické, a latentných foriem, ktoré sa vyskytujú bez klinických simptomov.Takzhe Táto metóda sa používa pre kontrolu chronických choroby. Skúsme pochopiť, čo táto metóda je a na akých princípoch je založený?

Komponenty linked ImmunoSorbent assay - imunitnú odpoveď a enzymatické reakcie

Enzymatická imunoanalýza, ako meno napovedá, sa skladá z dvoch rôznych zložiek - imunitných reakcií a enzymatických reakcií. Imunitná reakcia vytvára väzobné biologické molekuly, bunky alebo buniek mikroorganizmov, ktoré sú v skutočnosti snaží nájsť a enzymatická reakcia nám umožňuje vidieť a merať imunologický reakcie. To znamená, že imunitná odpoveď - je súčasťou komplexného techniky, ktorá v skutočnosti detekuje požadovaný mikróbov. Enzymatické reakcie - je to, že súčasťou komplexného techniky, ktorá umožňuje prekladať výsledok imunitnej odpovede vo forme oka viditeľné a prístupné meranie bežných chemických techník. na takomto spôsobe konštrukcie imunotest, sme analyzovať obe strany samostatne.

Imunitná odpoveď, ktorá je? Čo je protilátka, antigén?

Čo je to imunitná odpoveď? Čo je to antigén?
Najprv analyzovať, čo imunitnej odpovede. imunitnej odpovede - špecifická väzbové reakcie antigénu s protilátkou za vzniku imunitného komplexu. Čo to znamená? Na povrchu každej bunke akéhokoľvek organizmu existujú zvláštne štruktúry zvané antigény. Antigény všeobecne - sú molekuly, ktoré nesú informácie o bunke (ako informácie o odznaku u človeka, ktorý stanovuje základné údaje o osobe).

Individuálne a špecifické antigény - čo to je? Prečo potrebujeme tieto antigény?

existujú jednotlivé antigény, ktoré je jedinečné pre tohto konkrétneho organizmu. Tieto jednotlivé antigény sa líši od všetkých ľudí, tam je podobná k sebe, ale napriek tomu sa líšia. Dve identické kópie jednotlivých antigénov neexistujú!

Druhou hlavnou typ antigénu - je antigény druh, ktorá je vlastná v každom z jednotlivých druhov živých tvorov. Napríklad, osoba je prítomný špecifický antigén, ktorý je spoločný pre všetkých ľudí, u myší, že je myšou antigén druh, atď Na povrchu každého článku sú nutne predstavovať druhy a individuálne antigén.

Použitý špecifický antigén buniek imunitného systému pre uznanie. "- niekoho iného"

Ako je rozpoznanie antigén?

Imunitné bunky spojené s podozrivou bunky a nesie označenie je na individuálnej antigénu. Imunitný pamäť "zapísať" bunka vyzerá "jej antigénu." Teda, v prípade, zhodovať s antigén podozrivé bunky popis "jej antigén", znamená to, že bunky vlastného tela a nie vážne. Potom sa bunky imunitného systému "neviazaná" a odchádza. A v prípade, že antigén nie je rovnaký ako opis "a", zatiaľ čo bunky imunitného systému identifikuje bunku ako, cudzie 'a teda potenciálne nebezpečné pre celý organizmus. V tomto prípade sa bunky imunitného systému nie je "neviazaná" a začne ničiť nebezpečný objekt. Presnosť takéhoto imunologické rozpoznávanie je ohromujúci - 99,97%. prakticky žiadne chyby!

Čo je protilátka imúnny komplex?
Aký je protilátka?

Protilátka - špeciálna molekula sa nachádza na povrchu imunitných buniek. Že protilátka sa viaže na antigén a podozrivých buniek. Ďalšie protilátka prenáša informácie do bunky, kde sa uznanie, a obdrží spätný signál z dvoch typov "A" alebo "súpera." Ak je signál "a" protilátky rozrušuje komunikácie s antigénom a uvoľňuje buniek.

Čo je imúnny komplex?
Keď je "cudzie" Situácia signál odvíja inak. Protilátka nemusí prerušiť spojenie s antigénom, a naopak, odoslaním špecifické signály, spôsobuje "vystuženie". Biologicky to znamená, že ďalšie protilátky v druhej časti buniek začne pohybovať do oblasti, kde hrozí nebezpečenstvo signál, a tiež tvoriť väzbu medzi antigénom a zachytil. Nakoniec, je antigén je obklopený na všetkých stranách a pevne privyazan.Takoy antigén + protilátky zvané imunitný komplex. Od tej chvíle, likvidácii antigénu. Ale teraz podrobnosti o procese neutralizácie antigénu nemáme záujem.

Typov protilátok (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Protilátka - štruktúra proteínu, ktoré majú vždy chemický názov, ktorý sa používa ako synonymum pre expresiu protilátky. To znamená, protilátky sú imunoglobulíny =.

Existuje päť typov imunoglobulínov (Ig), ktoré sa viažu na rôzne typy antigénov v rôznych miestach ľudského tela (napr, koža, sliznice, krv, a tak ďalej. d.). To znamená, že protilátky majú deľby práce. Tieto imunoglobulíny sa nazývajú latinku - A, M, G, D, E a sú označené nasledovne - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

V diagnostike pomocou iba jeden typ protilátky, ktorá je najviac špecifický pre definovaný mikróbov. To znamená, že väzba protilátok sú definované s antigénom sa vždy deje. Najčastejšie sa používa IgG a IgM.

Tento princíp imunitnú odpoveď (unikátna špecifickosť a presnosť rozpoznávania stanovenom biologického objektu), je základom vysoká presnosť protilátky ImmunoSorbent pevnosť analiza.V rozpoznávajúci antigény, presnosť všetkých spôsobu imunotest je tiež lepšia.

enzymatická reakcia

Aká reakcia - enzýmovej? Čo je afinitná substrát a produkt?
Teraz považujeme enzymatické reakcie v metóde enzýmovej imunoanalýzy.

Aký je enzymatická reakcia?

enzymatická reakcia - chemická reakcia, v ktorom je jedna látka prevádza enzýmom do druhého. Látka, ktorá pôsobí na enzýmu substrát. Látka, ktorá sa získa dopadom enzýmu reakčný produkt. Vyznačujúci sa tým, rys enzymatické reakcie je to, že určitý enzým pôsobí iba na konkrétnom substráte. Táto vlastnosť enzýmu rozpoznať "ich" substrát nazýva afinita.

Tak, každý enzým má iba jeden, špecifickú odpoveď na to. Enzýmov v biologickom svete vie, že veľké množstvo, rovnako ako enzymatické reakcie. ELISA diagnostický používa iba niekoľko enzymatické reakcie - nie viac ako 10. Keď táto zvolená tak, enzýmová reakčný produkt, ktorý je sfarbený látky. Prečo je enzymatická reakcia výrobky musia byť maľoval? Pretože neexistuje žiadna jednoduchá chemická metóda pre výpočet koncentrácie látky v zafarbeného roztoku - colorimetry.

Metóda kolorimetria - podstata a princíp

colorimetry využíva meranie hustoty farieb roztoku a hustotou farby vypočítané koncentráciu veschestva.Pri Toto špeciálne zariadenie - kolorimetra opatrenia farba je hustota roztoku. V kolorimetria dva možné hustoty farby v závislosti od koncentrácie látky - je priamo úmerná závislosť alebo nepriamo úmerné. V priamom pomere, tým vyššia je koncentrácia látky, tým intenzívnejší je hustota farba roztoku. Nepriamo úmerne, že čím vyššia je koncentrácia látky, tým nižšia je farba je hustota roztoku. Technicky to sa uskutočňuje nasledovne: prijatých niekoľko roztokov známej koncentrácie látky meraná hustota týchto roztokov, koncentrácia je vynesená na hustoty farieb (kalibračný graf).

Ďalej, meranie hustoty farby roztoku, ktorého koncentrácia sa zdá, a kalibračná krivka je hodnota koncentrácie, ktorá zodpovedá úrovni nameraných hustoty farieb rastvora.V moderných automatických kolorimetre raz kalibrácia sa vykonáva, potom jednotka samotná konštrukcia kalibračnej krivky, ktorá zostáva v pamäti, a meranie automaticky.

peroxidázy: imunotest sa najčastejšie používa nasledujúce enzýmy alkalickej fosfatázy, avidín.

Vzhľadom k tomu, kombinovaných imunologických a enzymatické reakcie v ELISA? Teraz budeme pokračovať, aby zvážila skutočné enzýmového imunologického testu. Aké sú fázy, že zahŕňa a čo sa stane, keď sa tieto reakcie? Linked ImmunoSorbent assay je priama a nepriama.

Direct-linked ImmunoSorbent assay - štádiá

V priamom ELISA za použitia protilátok na identifikáciu antigén spojený s určitým štítkom. Tento konkrétny značka je substrátom pre enzymatické reakcie.

Pripevnenie antigénu na povrchový antigén a zlúčeninu jamiek s protilátkou

Ako priama enzymoimunoanalýzy? Vezmite biologického materiálu (krv, hlien stery, sterov) a umiestnené do špeciálnych jamiek. Biologický materiál je ponechaný v jamkách po dobu 15-30 minút, aby antigény by mohli prilepiť na povrch jamiek. Ďalej, v týchto jamiek sa pridá protilátka pre detekciu antigénu. To znamená, že identifikačné antigény, ako je napríklad syfilis, pridá protilátky proti syfilisu antigény. Tieto protilátky sú produkované priemyselnými metódami, a laboratórne kúpiť ready nabory.Dannuyu zmes materiálu a protilátky ponechať po určitú dobu (od 30 minút do 45 hodín), aby protilátky boli schopné nájsť a dostať sa do kontaktu s "ich" antigenom.Chem viac biologických antigény vzorky, tým viac protilátok kontaktu s nimi.

Odstránenie "zbytočných" protilátky

Ako už bolo uvedené, tieto protilátky sú tiež spojené s konkrétnym metkoy.Poskolku protilátok sa pridá v prebytku, nie všetky z nich sa do styku s antigény, a v prípade, že je vo vzorke nie je antigén, potom v dôsledku toho ani protilátka nie je v kontakte s požadovaným antigénom. Pre odstránenie "extra" protilátky, obsah jamiek práve nalial. Výsledkom je, že všetky protilátky "prebytok" sa odstráni, a ktoré sú spojené s antigénmi, ako antigény "lepený" na povrch jamiek. Jamky boli premyté niekoľkokrát sa špeciálne riešenie, ktoré umožňuje, aby umyť všetky "extra" protilátky.

Enzymatická reakcia - tvorba farebné zlúčeniny

Potom sa začína druhá fáza - enzymatické reakcie. Premyté jamky boli pridané do roztoku enzýmu a nechá sa stáť po dobu 30-60 minút. Tento enzým má afinitu k látke (špecifická tag), ktorá je spojená s protilátkou. Enzýmovej reakcie boli vykonávané, ako je v dôsledku čoho tento konkrétny štítok (substrát) je premenený na farebné látky (výrobku). Potom metóda kolorimetria je, že koncentrácia farebné látky. Vzhľadom k tomu, tento konkrétny značka je spojená s protilátkou, potom sa koncentrácia farebného reakčného produktu, sa rovná koncentrácii protilátky. Koncentrácia protilátok rovná antigénu koncentráciu. Tak, ako výsledok analýzy, dostaneme odpoveď, aká je koncentrácia detekovaného mikróbov alebo hormónu.

To je to, čo prejde rovno imunoanalýza. V súčasnej dobe sa však častejšie používať nepriame ImmunoSorbent assay, pretože citlivosť a presnosť nepriame vyššie ako priame. Takže, poďme nepriame enzýmového imunologického testu.

Nepriama enzýmová imunoanalýza - štádiá

V nepriamej ELISA dvoch fázach. V prvej fáze sa používajú neznačené protilátky k detekovateľné antigény, a v druhom stupni sa aplikuje na prvý protilátok značených protilátok neznačeného. To nie je dosiahnuté priamej väzby protilátky na antigén, a dvojitá kontrola: Väzba protilátky na antigén, načo sa väzba druhého komplexu protilátka s protilátkou + antigénu. Typicky sa protilátka pre prvý stupeň - myšou a na druhej - kozy.

Fixácia antigénov na povrchu jamiek a viazať antigén s neznačené protilátky
Rovnako ako pre priame enzymoimunoeseje vykonáva plot biologickým materiálom - krvné stery, šmuhy. Skúmali biologický materiál sa pridá do jamiek a nechá sa stáť po dobu 15-30 minút na lepenie k povrchovým antigénom jamiek. Potom boli jamky prispievajú neznačených protilátok na antigény a ponechá sa dobu (1-5 hodiny) na protilátku kontakte s "ich" antigény a vytvoreného imunitného komplexu (prvá etapa). Potom vyberte "prebytok", nenaviazanej protilátky vyliatím obsahu jamiek. Plákania so špeciálnym riešením pre úplné odstránenie všetkých non-viazanej protilátky.

Väzba protilátky označené na antigén, neoznačený protilátka +
Potom druhú protilátku - značeného, ​​pridané do jamiek a znova sa nechá stáť po určitú dobu - 15-30 minút (druhá noha). Počas tejto doby, značené protilátky sa viažu na prvý - nie sú označené a tvorí komplex protilátka - antigén + + protilátky. Avšak, označené, a značená protilátka sú zavedené do jamiek v prebytku. Z tohto dôvodu je potrebné ešte raz, aby sa odstránili "extra", už značených protilátok, ktoré sa viažu na neznačkovanej protilátku. Tento postup sa opakuje pre vylievanie obsahu jamiek a premytie špeciálnym roztokom.

Enzymatická reakcia - tvorba farebné zlúčeniny
Potom o enzým, že sa reakcia uskutočňuje konverziou "značky", vo farebnom látky. Zafarbenie počas 5-30 minút. Potom sa vykonáva kolorimetria a výpočet koncentrácie farebné látky. Vzhľadom k tomu, koncentrácia farebné látky je označená koncentrácia protilátky a koncentrácia značkovacej látky je rovná koncentráciu neznačených protilátok, čo sa rovná koncentrácii antigénu. Dostávame tak koncentráciu antigénu detekovateľné.
Takýto dvojitý ovládanie pomocou dvoch druhov protilátok zvýšila citlivosť a špecifickosť enzýmu imunoanalýza. Cez predĺženie doby analýzy a zaradenia ďalších krokov, tieto straty sú kompenzované presnosť výsledku. To je dôvod, prečo v súčasnej dobe drvivá väčšina enzýmových imunologických techník - to je nepriamym enzymoimuno.

Aké choroby sú detekované enzýmové imunoanalýzy diagnostiky?

Pozrime sa teraz, aký druh ochorenia a akékoľvek biologicky aktívna látka zistená enzymoimunoanalýzy. Látky detekované enzýmovým imunotest sú uvedené v tabuľke.


Nižšie uvedená tabuľka nie je kompletný zoznam testov (len najbežnejšie), vykonávaná pomocou ELISA. Priviesť celý zoznam nie je možné, pretože to bude veľmi veľký a neustále aktualizované. Okrem laboratórnej diagnostiky pomocou enzýmovej imunoanalýzy sa široko používa vo vedeckom výskume.




Autor: AK Nasedkina