PCR (polymerázová reťazová reakcia). Ako je diagnóza PCR, indikácia, ako sa pripraviť na štúdium, PCR výsledky

Pre primerané a účinnej liečbe mnohých infekčných ochorení musí byť včas stanoviť presnú diagnózu. Pri riešení tohto problému dnes zapojené high-tech diagnostické metódy založené na metód molekulárnej biológie. V súčasnej dobe, polymerázová reťazová reakcia (PCR), sa už široko používa v lekárskej praxi ako najspoľahlivejšie nástroj na účely diagnózy.

Čo je príčinou popularity PCR v túto chvíľu?

Po prvé, táto metóda sa používa na detekciu patogénov rôznych infekčných ochorení s vysokou presnosťou.

Po druhé, pre sledovanie účinnosti liečby.

V rôznych návodov, brožúr, článkov a vysvetlenie lekárov, sme často stretávajú s používaním nejasných pojmov a slov. V skutočnosti je ťažké hovoriť o high-tech produkty vedy bežných slov.

Čo je podstatou a mechanika diagnostické PCR?

Každý živý organizmus má svoje vlastné jedinečné gény. Tieto gény sú usporiadané v molekule DNA, ktorá je v skutočnosti "karta" každého konkrétneho organizmu. DNA (genetický materiál) - veľmi dlhá molekula, ktorá sa skladá z "tehly" zvané nukleotidy. Každý budič že leží úplne špecifické infekčné ochorenie, to znamená v určitom poradí a kombinácii. Ak je nutné pochopiť, či osoba má daný patogén, stúpa biologického materiálu (krv, moč, sliny, tampóny), ktorý obsahuje DNA alebo fragmentov DNA mikróbov. Ale množstvo genetického materiálu patogénu je veľmi malá, a to je nemožné povedať, čo presne je mikroorganizmus mu patrí. Pre vyriešenie tohto problému a slúži ako PCR. Podstatou PCR je to, že malé množstvo materiálu, je považovaná za vyšetrovanie, obsahujúce DNA, a proces PCR je zvýšenie počtu genetického materiálu, ktorý patrí do určitého patogénu, a tak, že môže byť identifikovaný.

diagnostika PCR - genetické štúdie biomateriáli.

Myšlienka PCR patrí americký vedec K.Mullins, ktorú navrhla v roku 1983. Avšak, rozšírené klinické použitie získala iba v strednom 90s XXveka.

Budeme rozumieť terminológiu, že je to - DNA, atď. Každá bunka každého živého tvora (zviera, rastlina, človek, baktérie, vírusy) má chromozóm. Chromozómy - chovatelia Táto genetická informácia, ktoré zahŕňajú celú sekvenciu génov každej jednotlivej živej bytosti.

Každý chromozóm je zložený z dvoch reťazcov DNA, stočených do špirály vzhľadom k sebe navzájom. DNA - deoxyribonukleová kyselina je chemicky, ktoré sa skladajú z konštrukčných prvkov - nukleotidov. 5 je Nukleotidová druh - tymín (T), adenozín (A), guanín (G), cytozín (C) a uracil (U). Nukleotidy sú usporiadané za sebou v danom poradí jednotlivých tvarovacích génov. Jeden gén sa môže skladať z 20-200 nukleotidov takých. Napríklad, gén kódujúci na výrobu inzulínu, sa skladá z 60 bp.

Nukleotidy sú majetkom komplementarity. To znamená, že opačný na adenín (A) v jednom reťazci DNA požadovanej je tymínu (T), na druhom reťazci, a naproti guanín (G) - cytozín (C). Schematicky takto:
D - D
T - A
A - T
Táto kľúčová vlastnosť komplementarity pre PCR.

Okrem DNA rovnakú štruktúru RNA - ribonukleová kyselina, ktorá sa líši od DNA v tom, že namiesto toho, tymín, uracil je v ňom použitý. RNA - genetická informácia je správcom niektorých vírusov, tzv retrovírusy (napríklad HIV).

       DNA a RNA molekuly môžu byť "násobiť" (táto vlastnosť sa používa pre PCR). K tomu dochádza nasledovne: dve vlákna DNA alebo RNA, odchýliť sa od každej strane druhej, každé vlákno dostane špeciálny enzým, ktorý syntetizuje nový reťaz. Syntéza je princíp komplementarity, tj, ak sa v pôvodnej DNA reťazce za nukleotidov A, potom sa novo syntetizovaný bude T, ak je T - potom C, atď. Tento špeciálny enzým "builder" v prípade potreby "semeno" pre začatie syntézy - sekvencie nukleotidov 5-15. Tento "semeno" je definovaný pre každý gén (gén chlamýdie, mykoplazmy, vírusy) experimentálne.

Tak každý PCR cyklus sa skladá z troch krokov. V prvom kroku dochádza k tzv odvíjanie DNA - to je prepojený separácia dvoch reťazcov DNA. V druhej - je "semeno" spojenie do miesta reťazcov DNA. Napokon, rozšírenie dátovej reťazca DNA, ktorý je vyrobený fermentom- "builder". V súčasnej dobe je tento komplex proces sa vyskytuje v jednej skúmavke a pozostáva z opakujúcich sa cyklov reprodukčného definovanú DNA vyrobiť veľký počet kópií, ktoré môžu byť následne detekované bežnými spôsobmi. To je jeden z reťazcov DNA dostávame stovky alebo tisíce.

Etapy PCR štúdiách

Odber vzoriek biologického materiálu pre výskum

Vzhľadom k tomu, vzorka je iný biologický materiál, krv a jej zložky, moč, sliny, slizničné sekréty, mozgovomiechová mok, sekréty z rany plôch, obsah telových dutín. Všetky biologické skúšky zhromaždené na jedno použitie nástroja, a vytočil materiál uzavretý v sterilnej plastovou rúrkou alebo umiestnené na kultivačnom médiu s následnou prepravy do laboratória.

Získanú vzorky sa pridá potrebné reagencie a dať do programovateľný termostat - termocykléra (termocykléra). Termocykléra PCR opakuje 30-50 krát cyklus pozostávajúci z troch fáz (denaturácia, žíhanie a predĺženie). Čo to znamená? Pozrime sa na podrobnosti.

Fáza zneužiť PCR reakciu, kopírovanie genetického materiálu

ja stupeň PCR - Príprava na kopírovanie genetického materiálu.
Vyskytuje sa pri teplote 95 ° C, molekuly DNA sa oddelí a môžu sedieť "primer".

"Primery" sa vyrába priemyselným spôsobom rôzne vedecké a priemyselné zväzy a laboratória kúpiť ready-made. Ďalej len "osivo" pre identifikáciu, ako sú chlamýdie, funguje len pre chlamýdie, atď. Teda, v prípade, že biologický materiál je testovaný na prítomnosť chlamýdiovej infekcie, potom sa reakčná zmes umiestni "osivo" pre hlamidiy- pokiaľ testovanie Biomateriál na vírus Epstein-Barrovej, a "semeno" pre vírus Epstein-Barrovej.

II stupeň - odbor genetického materiálu infekčného agens a "semeno".
Ak je DNA definovaná vírusy alebo baktérie, "semeno" sedí na DNA. Proces spájania "osivo", je druhá fáza PCR. Tento krok sa vykonáva pri teplote 75 ° C

III etapa - kópia genetického materiálu infekčného agens.
Tento proces vlastne predĺženie alebo rozmnožovanie genetického materiálu, ktorý sa vyskytuje pri teplote 72 ° C Pod pojmom "semeno" je vhodný enzým "builder" a syntetizuje nový reťazec DNA. S koncom syntézy nového koncov reťazca DNA a PCR cyklu. To znamená, že jedno číslo cyklu PCR sa zvyšuje genetický materiál dvakrát. Napríklad, v pôvodnom vzorke mal 100 molekúl DNA akéhokoľvek vírusu, po prvom cykle PCR vo vzorke bude DNA molekuly pre 200 skúšobného vírusu. Cyklus trvá po dobu 2-3 minút.

Pre vytvorenie dostatočného množstva genetického materiálu pre identifikáciu, boli vykonané vo všeobecnosti 30 až 50 cyklov PCR, ktorá trvá 2-3 hodín.

Úroveň Identifikácia šírené genetický materiál

V skutočnosti PCR tu končí a ďalej je nemenej významný stupeň identifikácie. Pre identifikáciu metódou elektroforézy alebo označené ako "primer". Keď sa používajú elektroforéza získať reťazca DNA oddelené podľa veľkosti, a prítomnosť DNA fragmenty rôznej dĺžky, ktorý ukazuje pozitívny výsledok analýzy (to znamená, že prítomnosť vírusu, baktérie, atď.). Pri použití značeného "semeno" je pridaný chromogén (farbivo) do finálneho reakčného produktu, pričom sa enzymatická reakcia sprevádzané vyfarbenie. Farba Vývoj je priamy dôkaz, že vírus alebo iné detekovateľné činidlo sú prítomné v pôvodnom vzorke.

K dnešnému dňu, pomocou značené "primer", ako aj príslušný softvér, je možné vyrábať naraz a "čítať" výsledky PCR. Je to tak nazyvaemayareal-time PCR.

Prečo diagnostiku PCR má túto hodnotu?

Jednou z významných výhod metódy PCR je vysoká citlivosť - 95 až 100%. Avšak, tieto výhody by mali byť založené na vždy za nasledujúcich podmienok:

1. správny výber, prepravu biologického materiálu;
2. dostupnosti sterilných jednorazových nástrojov, špecializovaných laboratóriách a vyškoleným personálom;
3. prísne dodržiavanie sterilných podmienok a pri analýze

Citlivosť sa líšia pre rôzne baktérie zistené. Napríklad, citlivosť metódy PCR pre detekciu vírusu hepatitídy C je 97 až 98%, je citlivosť pre detekciu Ureaplasma - 99-100%.

Možnosti spojená s analýzou PCR, môžu dosiahnuť bezkonkurenčný analytickú špecifickosť. To znamená, že identifikácia mikroorganizmu je, že hľadajú, nie sú podobné alebo úzko súvisí.
Diagnostická citlivosť a špecifickosť metódou PCR, často vyššie ako tie, pre kultivačné metódou, ktorá sa nazýva "zlatý štandard" pre detekciu infekčných ochorení. S ohľadom na trvanie rastúce kultúry (od niekoľkých dní do niekoľkých týždňov), tú výhodu, že PCR je evidentná.

PCR v diagnostike infekcií
Výhody metódou PCR (citlivosť a špecifickosť) definovať širokú škálu aplikácií v modernej medicíne.
Hlavné aplikácie diagnostiky PCR:

1. Diagnostika akútnych a chronických infekčných chorôb rôzneho lokalizácia
2. monitorovanie efektívnosti terapie
3. objasnenie typ patogénu

PCR sa používa v pôrodníctve, gynekológii a neonatológia a pediatria, urológii, Venerológia, nefrológiu, infekčné ochorenia, kliniky oftalmológia, neurológia, Phthisiopneumology kolies.

Použitie PCR diagnostika sa vykonáva v spojení s inými výskumné metódy (ELISA, PIF, NIF a kol.). Ich kombinácie a určuje vhodnosť ošetrujúcim lekárom.

infekčné agens zistené metódou PCR

vírusy:

1. Retrovírusy HIV-1 a HIV-2
2. herpetiformis vírusy
3. vírusom herpes simplex typu 1 a 2
4. cytomegalovírus
5. vírus Epstein-Barrovej
6. Varicella - zoster vírus
7. ľudské herpes vírusy 6 a 7
8. hepatitída C, B a A
9. vírusy, ľudský papilloma
10. rubivirus
11. adenovírusy
12. rhinovírusy
13. parvovirus
14. pikornovirusy

baktérie:

1. mykobaktérie
2. chlamýdie
3. mykoplazmám
4. salmonela
5. Legionella
6. klostrídií
7. bledá Treponema
8. Rôzne druhy patogénne E. coli
9. Vibrio cholerae
10. Rickettsia
11. aurococcus
12.  pôvodca bakteriálnej meningitídy
13. Helicobacter pylori
14. Ureaplasma
15. kvapavka
16. záškrt bacil
17. Haemophilus influenzae

V tomto zozname sú najčastejšie infekčné agens detekované pomocou PCR. V skutočnosti je tento zoznam je oveľa širší, neustále aktualizované, ako sa syntetizuje nový "semeno". Rovnako je potrebné poznamenať, že zoznam identifikovaných patogénov je určená prítomnosťou "semená" pre identifikáciu v arzenálu každej jednotlivej laboratória.


Autor: AK Nasedkina